Пцр анализ виды

Содержание
  1. Типы ПЦР
  2. Применение
  3. Другие разновидности ПЦР
  4. Способы осуществления ПЦР
  5. Анализы ПЦР на 12 инфекций: сущность и правила сдачи
  6. Преимущества ПЦР диагностики
  7. Основа полимеразной цепной реакции
  8. Инфекции, выявляемые ПЦР-анализом
  9. Правила сбора материала на анализ
  10. Сдача анализа: особенности процедуры и расшифровка результатов
  11. Расшифровка результатов
  12. Точность ПЦР диагностики
  13. Пцр на скрытый инфекционный процесс
  14. Типы ПЦР анализа
  15. Качественный ПЦР на гепатит С
  16. Пцр количественный на гепатит с
  17. Анализ крови на ПЦР
  18. Специфика метода ПЦР крови на инфекции
  19. Области применения анализа
  20. Спектр возможностей ПЦР в диагностике инфекций
  21. Показания к проведению ПЦР-12
  22. Основные достоинства PCR
  23. О результатах и ценах
  24. Итоги
  25. Основные виды ПЦР
  26. Различные виды ПЦР-методов, основанных на термоциклировании (стадии нагревания и охлаждения)
  27. Множественная ПЦР (Multiplex PCR)
  28. «Гнездовая» или вложенная ПЦР (Nested PCR)
  29. Лигазная цепная реакция (Ligase Chain Reaction, LCR)
  30. Количественная ПЦР (Quantitative PCR, qPCR)
  31. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (real-time PCR)
  32. ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR)
  33. Различные виды ПЦР-методов, основанных на изотермической амплификации ДНК
  34. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)
  35. Репликация по типу катящегося кольца (Rolling Circle Amplification, RCA)
  36. Хеликаз зависимая ДНК амплификация (Helicase-Dependent DNA Amplification, HDA)

Типы ПЦР

Пцр анализ виды

Полимеразная цепная реакция (polymerase chain reaction), общепринятые аббревиатуры – PCR, ПЦР. Относится к молекулярно-биологическим аналитическим методам.

Позволяет воспроизвести многократно кусочек ДНК из исследуемого образца, тем самым увеличивая его концентрацию в миллионы раз. За разработку метода ПЦР Кэри Мюллису была присуждена Нобелевская премия в 1993 году.

Применение

Относительно использования в медицине данный метод обеспечил возможность диагностики самых различных заболеваний и состояний.

Проводится ПЦР на:

  • туберкулез
  • ИППП
  • генетические отклонения
  • опухолевые заболевания
  • герпес (6 типа, вызывающий такое распространенное в детском возрасте заболевание, как розеола, анализ на ВПГ 1 и 2 типа)
  • гепатиты (анализ ПЦР качественный/количественный на гепатит С (ц), В (б))
  • папилломавирусную инфекцию (анализ ПЦР на онкогенные типы ‑ ВПЧ 16 и 18 типа) и др.

В иммунологических исследованиях часто используется ПЦР-рестрикционный анализ продуктов амплификации (PCR RFLP). Представляет собой комбинацию двух соответствующих методик. Это разрезание ДНК эндонуклеазами и последующий анализ кусочков методом ПЦР.

Существуют определенные показания к проведению ПЦР для диагностики инфекционных патологий, в том числе и ИППП:

  • для вирусов герпеса 1 и 2 типа, возбудителей генитального герпеса, метод оказался самым точным и достоверным из существующих лабораторных исследований
  • в отношении папилломавирусов человека метод находит применение с целью идентификации отдельных типов (типирование папилломавирусов) из групп высокого онкогенного риска (16, 18 типа и др.) – причины рака шейки матки, низкого онкогенного риска (6, 11 типов) – возбудителей остроконечных кондилом
  • при бактериальном вагинозе метод является основным для выявления маркеров заболевания (гарднерелл, мобилункуса и др.) и определения состава влагалищной микрофлоры, необходимых для подбора эффективной терапии
  • ПЦР позволяет определять цитомегаловирус в любых биологических тканях
  • в России метод широко используется для диагностики гонореи
  • метод показан для выявления хламидий у беременных при первичном посещении врача и еще раз в третьем триместре
  • метод важен при необходимости выявления кандидоза, вызванного грибками Candida nonalbicans, которые, в отличие от Candida albicans, характеризуются устойчивостью к распространенным антимикотическим препаратам и пр.

Также ПЦР используется в криминалистике, судебной медицине, генной инженерии, антропологии, палеонтологии, сельском хозяйстве, ветеринарии и т.д.

Молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты (собственно ДНК) состоит из двух связанных между собой цепочек из нуклеотидных звеньев.

При этом «голова» одной цепочки связана с «хвостом» другой. Водородные связи образуются между строго определенными азотистыми основаниями. В них различные для разных нуклеотидов части.

Так, например, гуанин из одной цепочки может связываться только с цитозином другой и т.д. Вот почему, если в наличии имеется одна цепочка ДНК, то следуя правилам взаимодействия можно воспроизвести вторую цепочку.

Такая особенность построения ДНК и стала сутью обсуждаемого метода.

Для реализации исследования требуются:

  • анализируемая ДНК или ее кусочек, который станет матрицей для копирования своей части
  • праймеры – созданные синтетически в лаборатории небольшие нуклеотидные последовательности, которые соответствуют по принципу взаимодействия нужным зонам анализируемой ДНК
  • нуклеотиды – «строительный материал»
  • ДНК-полимераза – выделенный из бактерий или архей (своеобразных одноклеточных безъядерных организмов) фермент, который запускает реакцию синтеза от одного конца праймера
  • буфер – раствор, который обеспечивает поддержание необходимой для работы фермента кислотности среды, а также содержит вещества, препятствующие прилипанию реагентов к стенкам реакционного сосуда и предотвращающие нежелательные побочные взаимодействия.

Все смешивают в дистиллированной воде и помещают в амплификатор. Это специальное устройство, в котором реализуется периодические нагрев/охлаждение реакционной смеси с высокой точностью и за считанные секунды.

Обычно требуется синтез кусочков ДНК из 2000-3000 нуклеотидных пар, что достигается за два-три десятка трехэтапных циклов.

Циклы:

  1. Денатурация – разрушение водородных связей путем нагрева и разъединение в результате двух цепочек ДНК.
  2. Отжиг праймеров – присоединение праймеров к освободившимся молекулам ДНК с разных сторон кусочка, который требуется скопировать. Реакция проводится при строго заданной температуре, чтобы данные праймеры взаимодействовали только с нужными зонами. Разработку праймеров проводят с предварительным расчетом с помощью компьютерных программ с учетом всех требований.
  3. Синтез ДНК – собственно построение ДНК-цепи полимеразой из нуклеотидных «кирпичиков». Сначала фермент «крепится» к комплексу матрица-праймер, а затем подбирает необходимый нуклеотид из раствора согласно принципу взаимодействия. Скорость реакции ‑ примерно 3000 нуклеотидов в минуту. Полученная новая молекула служит еще одной матрицей и проходит вместе с «родительской» весь цикл. В результате, количество продукта увеличивается все быстрее и быстрее.

После завершения синтеза на специальном геле с окрашиванием проводят элетрофорез реакционной смеси. Цель – пространственное разделение молекул ДНК, которые становятся заметны визуально (или под УФ-светом). Данный метод позволяет установить, есть ли определенная последовательность нуклеотидных звеньев в исследуемой ДНК. Называется «качественный метод ПЦР».

Другие разновидности ПЦР

Если в роли матрицы исследуемой выступает РНК (например, при изучении РНК вирусов), используется ПЦР с обратной транскрипцией (RT PCR, который важно отличать от такой разновидности, как метод real-time PCR).

В данном варианте используется обратная транскриптаза. Это фермент, который по имеющейся РНК выстраивает соответствующую ей ДНК, после чего проводится обычная ПЦР.

Для установления в исследуемом материале числа молекул ДНК применяется количественная ПЦР.

Которая и называется real-time PCR, ПЦР «в реальном времени». В этой технике также возможно использование РНК.

В чем заключается главное отличие качественного и количественного методов ПЦР? В последнем случае после каждого цикла проводится замер количества воспроизведенной молекулы флюоресцентными методами. В практической медицине то, какой метод ПЦР качественный или количественный для анализа на инфекции необходим, определяет врач.

На основании предполагаемого диагноза и цели исследования (например, для контроля эффективности лечения). В таком режиме часто проводится ПЦР на гепатит С или В. Причем при качественном определении расшифровка результатов не представляет сложности для неспециалиста. Положительный результат – «обнаружено», т.е.

выявлен фрагмент ДНК вируса, отрицательный – «не обнаружено». Расшифровать количественный анализ ПЦР на гепатит С можно, воспользовавшись референсными значениями лаборатории, проводившей исследование. Результат «не обнаружено» указывается, если вирусная ДНК вообще не выявлена.

Или ее количество меньше предела чувствительности (15-20 МЕ/мл).

  • «Меньше 10 во 2-й степени МЕ/мл» –положительный результат с соответствующим содержанием вируса.
  • «От 10 во 2-й степени до 10 в 8-й степени МЕ/мл» – положительный результат с содержанием вирусных частиц в указанных пределах.
  • «Более 10 в 8-й степени» ‑ концентрация превышает указанное число.

Результат выше верхнего предела измеряемого диапазона, не определяется с достаточной точностью. Различные варианты ПЦР могут использоваться для исследования не ДНК/РНК, а гормонов, токсинов, антител и иных молекул.

Принцип такой иммуно-ПЦР ‑ присоединение к выявляемым молекулам (антигенам) ДНК-меченных антител. С последующим копированием ДНК-частей и определением типа и количества анализируемых молекул.

Метод позволяет обнаружить инфекционные антигены на самых ранних стадиях болезни.

Способы осуществления ПЦР

На сегодняшний день существует несколько десятков методик для реализации ПЦР:

  • с горячим стартом – в реакционную среду вносят полимеразу в комплексном соединении с антителами, ингибирующими ее деятельность (поэтому фермент «высвобождается» только в заданный момент реакции);
  • ступенчатая – первые несколько циклов реализуют при более высоких температурах праймерного отжига для увеличения специфичности связывания последних с матричной ДНК, а после накопления некоторого количества новых ДНК-молекул температуру снижают до оптимальной;
  • мультиплексная – для выявления сразу нескольких последовательностей используют набор различных праймеров
  • метод RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA – анализ ПЦР случайных полиморфных фрагментов ДНК) – позволяет различить сходные по структуре молекулы, например, дифференцировать виды бактерий, за счет использования очень небольшого праймера (не более 10 нуклеотидов)
  • асимметричная – применяют при необходимости скопировать только одну цепочку анализируемой ДНК, для чего один из праймеров берется в заметном избытке
  • вложенная – используют для снижения количества побочных продуктов за счет добавления двух праймерных наборов и проведения двух реакций последовательно (сначала с праймером для копирования длинного фрагмента, затем – короткого)
  • инвертированная – к методу прибегают, когда последовательность некоторого участка цепи известна, но копирование требуется для другого участка, для чего проводят
    • «разрезание» ДНК рестриктазой
    • «закольцовывание» фрагмента лигазой, так что известные участки оказываются на концах неизвестного
    • проведение стандартной ПЦР
  • цифровая капельная – более точная, чем вариант «в реальном времени», основана на разделении пробы на множество маленьких капель и реализации полимеризации в каждой из них
  • виртуальная – представляет собой аналитический подход для теоретической ПЦР, позволяет оптимизировать подбор праймеров, предсказывать результат копирования и т.д.
  • многое другое.

Таким образом, на сегодняшний день метод является самым мощным вариантом лабораторного исследования.

Его неоспоримые плюсы:

  • высочайшая точность и специфичность
  • совместимость с иными техниками
  • высокая пластичность – возможность решать самые разнообразные задачи
  • постоянное совершенствование, появление новых разновидностей и типов.

Важно понимать, что метод высокочувствителен к минимальным количествам ДНК. Поэтому необходимо очень тщательно соблюдать правила сбора биологического материала. Исключается даже малейшая вероятность загрязнения (со стороны окружающей среды, рук персонала и т.д.).

Источник: https://prosifilis.ru/content/tipy-pcr

Анализы ПЦР на 12 инфекций: сущность и правила сдачи

Пцр анализ виды

ПЦР диагностика — это методика, основанная на применении полимеразной цепной реакции, с помощью которой можно обследовать человека на инфекционные и наследственные заболевания.

Анализы ПЦР на 12 инфекций показывают результат, несмотря на то, остро протекает заболевание или хронически. Некоторые специалисты считают ПЦР 12 обязательным анализом и не ставят без него окончательный диагноз.

Результаты могут быть положительными даже задолго до появления симптоматики болезни.

В 20 веке Кэри Мюллис из США открыл явление полимеразной цепной реакции. В настоящее время метод ПЦР является золотым стандартом в некоторых сферах медицины. Метод является максимально эффективным для выявления болезни в активной стадии, поскольку бывают случаи, что в активной стадии обычные методы не дают такого точного результата.

Преимущества ПЦР диагностики

Диагностика инфекционных процессов при помощи ПЦР достаточно актуальна в современном мире. Преимуществами данного вида обследований являются следующие моменты:

  1. Обнаружение инфекционного возбудителя в анализах. Анализ предполагает выявление ДНК или РНК инфекционного агента.
  2. Практически исключены ложные и ошибочные реакции.
  3. Методика ПЦР 12 максимально чувствительная. Благодаря данному методу можно обнаружить даже единичные клетки инфекционных агентов.
  4. Результат ПЦР на скрытые возбудители готов уже через 4 часа после проведения процедуры.
  5. Способность обнаружения инфекционных агентов без отсутствия характерной симптоматики для заболевания. Метод достаточно эффективен и по происшествии конкретной болезни.

В современном мире ПЦР диагностика инфекций развивается ускоренными темпами. Методика активно совершенствуется. Появляются новые подвиды обследования ПЦР. Благодаря развитию данного метода обследования он становится максимально доступным широкому кругу людей, а стоимость при этом постепенно изменяется.

Основа полимеразной цепной реакции

Метод ПЦР проводится исключительно в лабораторных условиях. Для его осуществления используются специальные ферменты, которые увеличивают в несколько раз структуру ДНК и РНК больного.

Должно образоваться такое число ДНК и РНК, чтобы можно было провести визуальный анализ.

Во время обследования происходит копирование того участка РНК или ДНК, который идеально подходит под требуемые условия.

В лаборатории существует соответствующая база данных, в которой указано точное строение различных инфекционных агентов. Благодаря методу ПЦР можно не просто увидеть возбудителя, но и подсчитать его количественное соотношение.

ПЦР-диагностика предполагает и определенные новшества, среди которых можно выделить следующие:

  • введение мутаций;
  • соединение отдельных фрагментов ДНК;
  • определение отцовства и др.

Инфекции, выявляемые ПЦР-анализом

ПЦР диагностика может выявить следующие инфекционные процессы:

  • ВИЧ;
  • гепатиты следующих разновидностей: А, В, С, G;
  • вирус Эпштейн-Барра, возбудитель инфекционного мононуклеоза;
  • цитомегаловирус;
  • микобактерии туберкулеза;
  • герпес 1 и 2 типа;
  • многие инфекции, передающиеся половым путем: уреаплазмоз, гарднереллез, хламидиоз, микоплазмоз, трихомониаз.
  • ВПЧ и его онкогенные подвиды;
  • клещевой энцефалит и боррелиоз;
  • кандидозная инфекция;
  • листериоз;
  • инфекция хеликобактер пилори.

И это лишь часть наиболее распространенных инфекций, которые можно выявить при помощи ПЦР. ПЦР анализ крови активно применяется в гинекологической сфере медицинской практики, а также в таких областях, как:

  • пульмонологическая;
  • фтизиатрическая;
  • гастроэнтерологическая;
  • онкологическая;
  • многие другие разделы медицины.

Правила сбора материала на анализ

Чужеродные ДНК и РНК можно выявить, обследовав разнообразные биологические жидкости конкретного человека. Для того чтобы обследовать человека на присутствие определенных инфекций, передаваемых половым путем, необходимо взять на пробу выделения из половых органов (мазок или соскоб) больного и его мочу.

Если возникла необходимость обследовать человека на различного рода инфекции (ВИЧ, герпес, гепатит и другие), то берется ПЦР анализ, для чего используется кровь больного.

Чтобы диагностировать герпетическое поражение, мононуклеоз, нужно взять мазок из полости рта больного. Для подтверждения ЦМВИ для осуществления анализа берется моча больного. Возникают случаи, когда обследуют спинномозговую жидкость для выяснения причин возникших неврологических отклонений.

Врач-пульмонолог при этом обследует методом ПЦР мокроту и жидкость из плевры конкретного больного.

Если у новорожденного ребенка возникло подозрение на внутриутробное инфицирование, врачи берут анализ околоплодных вод у беременной женщины и кусочек тканей плаценты.

Сдача анализа: особенности процедуры и расшифровка результатов

Все пациенты, обследуемые по методу ПЦР, получают наиболее достоверный результат. В данном случае возникновение ошибок практически исключено. Результаты данного анализа готовятся достаточно быстро, что облегчает постановку диагноза и обеспечивает своевременное назначение лечебных мероприятий.

Достоверность результата ПЦР напрямую зависит от правильности сдачи материала на обследование. Материал не должен быть загрязнен, иначе результат исследования не будет объективен. К наиболее важным рекомендациям перед сдачей анализа ПЦР относятся следующие требования:

  1. Запрещено проявлять половую активность за сутки до проведения анализа.
  2. Анализ крови на инфекции необходимо сдавать на голодный желудок в утреннее время.
  3. Моча сдается утром в стерильный контейнер.

Результат анализа будет готов через 1,5-2 суток после проведения рассматриваемой процедуры. Встречаются такие ситуации, когда результат может быть подготовлен в тот же день.

Расшифровка результатов

Результат данного вида обследования может быть положительным и отрицательным. Отрицательный результат анализа крови говорит о том, что инфекционных элементов в сданном материале нет. Большое количество проведенных анализов ПЦР показывает отрицательный анализ.

Положительный анализ ПЦР подтверждает тот факт, что в сданном материале обнаружены инфекционные агенты и необходимо качественное, максимально эффективное лечение больного.

Результат может быть положительным, но какие-либо проявления заболевания отсутствуют. Это говорит или о начале заболевания, или о его носительстве. Если выявлено носительство болезни, то никакие лечебные мероприятия не требуются. Просто необходимо наблюдаться у специалиста. Примерами таких заболеваний являются:

  • папилломавирусная инфекция;
  • герпес и др.

Обычно их обнаруживают в слюне, соскобе из цервикального канала, уретре.

Однако необходимо помнить, что больной человек может заразить абсолютно здоровых, несмотря на то, что его данная болезнь никак не беспокоит. Заболевание может перейти в хроническую форму.

Следует отметить, что в тех случаях, когда ПЦР анализ крови показал положительный результат, назначение лечебных мероприятий просто необходимо.

Анализ ПЦР имеет еще и количественную характеристику. Количественный результат оценивает только специалист, он индивидуален для разных инфекций.

Основываясь на количественной характеристике, врач способен понять, насколько активен данный патологический процесс, поставить точную стадию развития конкретного заболевания.

Благодаря анализированию полученных результатов специалист может выбрать необходимый препарат и, возможно, пересмотреть дозировку препарата.

Точность ПЦР диагностики

Специалистам дают ПЦР 3 важнейших характеристики, среди которых выделяют:

  1. Точность.
  2. Специфичность.
  3. Чувствительность.

Диагностика инфекций методом ПЦР имеет большую вероятность обнаружения инфекционных агентов. ПЦР анализ крови и других жидкостей высокоспецифичен. С его помощью можно легко выявить конкретный инфекционный процесс. Диагностика ПЦР обладает высокой чувствительностью. Если в исследуемом материале содержится минимальное количество инфекционных агентов, метод ПЦР будет всегда положителен.

Наиболее редко бывает ложноположительный результат. Если инфекции нет, то и результат отрицателен.

Пцр на скрытый инфекционный процесс

Если у человека подозревают ИППП, то назначают анализ крови на скрытые инфекции. Половые заболевания можно выявить лишь путем обследования больного. Скрыто могут протекать такие заболевания, как:

  • хламидиоз;
  • уреаплазмоз;
  • гонорея;
  • герпес;
  • гарднереллез;
  • микоплазма.

Вышеперечисленные половые инфекции достаточно распространены и при этом коварны. На начальной стадии развития заболевания они не дают яркой симптоматики, и больные не обращаются за помощью. ПЦР анализ крови, соскобы со слизистой мочеиспускательного и цервикального канала обязательны при подозрении на эти инфекции.

ИППП очень негативно влияют на репродуктивную систему. Они способны вызвать бесплодие или пороки у плода. В связи с этим перед тем, как планировать беременность, нужно сдать анализ ПЦР.

Популярностью пользуется ПЦР на 12 инфекций. Диагностика методом ПЦР 12 проводится благодаря сдаче мазков из половых органов. Забор материала производится через 2 часа после акта мочеиспускания. За 2 дня до исследования нельзя вводить во влагалище суппозитории и проводить спринцевания. Результат анализа будет готов уже через 2 дня.

Стоимость ПЦР колеблется в зависимости от исследуемой инфекции. Цена находится в диапазоне от 200 до 500 рублей за каждую инфекцию. Войти и обследоваться в частной лаборатории можно и самостоятельно, без направления врача.

Источник: http://101analiz.ru/diagnostika-zabolevanij/analizy-pcr-12-infekcij.html

Типы ПЦР анализа

Пцр анализ виды

Полимеразная цепная реакция, сокращенно ПЦР.

Представляет собой метод, используемый для экспоненциальной амплификации определенной последовательности ДНК-мишени.

Позволяющей изолировать, секвенировать или клонировать одну РНК среди многих.

ПЦР была разработана более 30 лет назад, американским биохимиком Кэри Муллисом. 

Полимеразная реакция имеет широкое использование, применяется не только как анализ на ИППП.

Применение ПЦР практикуется в следующих направлениях: генотипирование:

  • клонирование
  • обнаружение мутаций
  • секвенирование
  • криминалистика
  • тестирование на отцовство

Как правило, ПЦР представляет собой трехступенчатую реакцию.

Образец, содержащий разбавленную концентрацию матричной ДНК, смешивают с термостабильной ДНК-полимеразой.

Такой как Taq-полимераза, праймер, дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP) и магний. 

На первой стадии ПЦР образец нагревают до 95-98 градусов.

На втором этапе температуру снижают до приблизительно 55-65 градусов.

На третьей стадии температуру обычно повышают до 72 градусов.

Эта последовательность денатурации, отжига, и расширения повторяется для множества циклов.

Что и приводит к экспоненциальному усилению матричной ДНК.

ПЦР достаточно сложный, но информативный метод исследования.

Зачастую применяется в диагностике патологий вирусной и инфекционной этиологии.

Анализ позволят практически со 100% точностью выявить и определить разновидность патогенного микроорганизма.

В последнее время, полимеразная реакция приобрела популярность в ранней диагностике туберкулеза.

Позволяет выявить возбудителя с 98% точностью на доклинической стадии. 

Преимущества диагностики туберкулеза при помощи ПЦР:

  • Максимально высокая точность обнаружения присутствия в организме Mycobacterium tuberculosis, за счет использования специального фермента, предназначенного для возбудителя туберкулеза. 
  • Высокая чувствительность анализа, как следствие, исследование способно обнаружить присутствие даже одной бактерии. 
  • Быстрота получения результатов диагностики. Тестирование проводится достаточно быстро, уже спустя 3-5 часов можно получить готовые результаты. 

Mycobacterium tuberculosis является внутриклеточным микобактериальным патогеном.

Представляет собой одно из самых распространенных и наиболее серьезных инфекционных заболеваний в мире.

Считается, что более 2 миллиардов людей имеют скрытую инфекцию M. Tuberculosis.

Около 8 миллионов — активную форму туберкулеза.

Кроме того, пациенты с ВИЧ и нарушением работы иммунитета на фоне заболевания чаще подвержены дополнительному инфицированию бактерией M. tuberculosis.

В их случае патология протекает сложнее, с многочисленными осложнениями.

ПЦР при подозрении на туберкулез является наиболее востребованным и точным анализом.

Способен выявить заболевание на самых ранних сроках, а также прибегнуть к своевременному, эффективному лечению.

Качественный ПЦР на гепатит С

В большинстве случаев, качественный ПЦР назначается при выявлении в организме пациента антител к гепатиту С.

Полимеразная реакция при подозрении на гепатит С проводится по следующему принципу.

Первое тестирование — на четвертую неделю после обнаружения антител.

Второе — на двенадцатую неделю, третье — на двадцать четвертую.

Далее анализ назначается на постоянной основе, один раз каждые 12 месяцев. 

Проведение полимеразной реакции на гепатит Б, А, Ц позволяет получить максимально точные результаты за счет высокой чувствительности теста от 10 до 500 МЕ/мл.

Это дает возможность определять наиболее низкие показатели присутствия в организме вируса и контролировать его дальнейшее развитие. 

Расшифровка результатов проводится лечащим врачом.

Положительный анализ говорить о наличии патогенного микроорганизма.

Отрицательный — чаще об отсутствии, но на 100% не исключает НСV. 

Взятие анализа на проведение ПЦР НСV проводится в утреннее время, биологическим материалом является венозная кровь. 

Пцр количественный на гепатит с

Количественная полимеразная реакция назначается пациентам, уже имеющим диагноз «гепатит С».

Задача анализа выявить вирусную нагрузку на организм.

Определить количественное присутствие патогена, а также понять, насколько проводимая терапия эффективна.

Расшифровать результаты диагностического исследования поможет лечащей врач-гепатолог.

Источник: https://kvd-moskva.ru/tipy-pcr-analiza/

Анализ крови на ПЦР

Пцр анализ виды

ПЦР или полимеразная цепная реакция (Рolymerase Сhain Reaction) – это высокоинформативный метод диагностики, предназначенный для выявления генетических отклонений и дифференциации инфекционных заболеваний.

Клинико-лабораторная оценка биоматериала (крови, мочи и т.п.) основана на определении генно-молекулярной структуры возбудителя инфекции, что нивелирует риск ложноположительного результата анализа. За научно-медицинскую ценность метода его разработчик Кэри Мюллис был удостоен Нобелевской премии в 1993 г.

Специфика метода ПЦР крови на инфекции

Анализ крови на ПЦР (PCR) обнаруживает активных инфекционных агентов и неактивных патогенов, погибших под воздействием медицинских препаратов, на любом этапе развития болезни. Такая способность обусловлена выявлением не просто возбудителя инфекции, а его генома:

  • ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) бактерий, паразитов, грибков;
  • РНК (рибонуклеиновой кислоты) вирусов.

Пробирку с образцом крови, взятой у пациента, размещают в амплификаторе – реакторе, обеспечивающем последовательное нагревание и охлаждение образца. К биоматериалу добавляют реакционную смесь. В амплификаторе производится более 30 циклов смены температурного режима, каждый из которых включает 3 этапа (денатурацию, отжиг праймеров, элонгацию).

В ходе многократной реакции амплификации:

  • разрываются водородные цепи макромолекул (ДНК и РНК);
  • образуются комплементарные комплексы матрицы с короткими фрагментами РНК и ДНК (праймеры);
  • термостойка ДНК-полимераза достраивает матричную цепь, и формирует множественные генетические копии возбудителя.

При достаточном количестве копий амплификатор дает качественно-количественную оценку обнаруженному возбудителю. Таким образом, молекулярная диагностика решает три задачи одновременно:

  • обнаруживает инфекционного агента;
  • дифференцирует его принадлежность (вирус, бактерия и т. д) и разновидность;
  • определяет дальнейшую тактику лечения и выбор медикаментов (в соответствии с установленным заболеванием).

ПЦР крови применяют для определения вирусов и бактерий либо тяжелых паразитарных внекишечных инвазий. Генная информация является уникальной, поэтому точность исследования ПЦР практически 100%. Рolymerase Сhain Reaction определяет инфекцию даже при отсутствии активности возбудителя и выраженных симптомов болезни.

Области применения анализа

В настоящее время в медицине и криминалистике, а также для клонирования генов и установления родственных связей применяют более десятка разновидностей амплификации. В ежедневной практике кровь на ПЦР назначают медицинские специалисты:

  • педиатр;
  • гинеколог;
  • уролог;
  • дерматовенеролог;
  • инфекционист;
  • фтизиатр;
  • пульмонолог.

Генно-молекулярная диагностика успешно применяется в неонатологии. С помощью полимеразной цепной реакции выявляют возможное заражение младенцев внутриутробно и сразу после появления на свет. Для детей с риском инфицирования анализ проводят в первые 48 часов после рождения и повторно в возрасте 3-6 месяцев.

Кроме инфекционных заболеваний, Рolymerase Сhain Reaction помогает диагностировать наследственные аномалии и мутации. В перинатальный период методом ПЦР у будущего малыша можно обнаружить:

  • гемофилию – нарушение свертываемости крови;
  • болезнь Хантера – патологии обменных процессов;
  • мусковидоз – нарушение внешнесекреторной функции желез;
  • нервно-мышечную миодистрофию Дюшенна-Беккера;
  • первичный иммунодефицит;
  • синдром Альпорта – патологию почек.

PCR используют для определения мутантных генов и их РНК-продуктов в диагностике онкологических заболеваний. Высокая чувствительность молекулярного метода обеспечивает выявление онкопатологий в доклинической стадии, когда очаг опухоли не превышает 0,01 см3 в размерах.

Анализ крови на ВПЧ

По обнаруженным онкогенам, биологическим канцерогенам и антионкогенам диагностируют исходную стадию:

  • онкогематологических болезней (рака крови и лимфатической системы);
  • злокачественных образований молочных желез;
  • аденокарциномы толстой кишки;
  • меланомы;
  • рака ротоглотки;
  • наследственных форм рака.

Высокой онкогенностью обладают штаммы 16, 18, 31, 33, 35 ВПЧ (вируса папилломы человека). В 50% случаев вызывают карциному шейки матки у женщин – раковую опухоль эпителиальных клеток. Обнаружение неопластических клеток в доклинической стадии рака значительно повышает шансы на успешное лечение болезни.

Особую ценность ПЦР имеет для Службы крови. Метод позволяет определить заражение гепатитами, ВИЧ, сифилисом в бессимптомный инкубационный период. На этой стадии иммунная система еще не продуцирует антитела к возбудителям, и выявить заболевания с помощью серологических исследований невозможно.

Проверка донорской крови ПЦР предупреждает возможное инфицирование реципиента

Спектр возможностей ПЦР в диагностике инфекций

Анализ полимеразной цепной реакции крови используется для выявления ЗППП (заболеваний, передающихся половым путем) и урогенитальных инфекций, инфекционных болезней легких, печени, пищеварительной системы, так называемых, детских болезней.

Краткий перечень возбудителей и заболеваний, определяемых по крови, мазку и моче

Вирусы
герпесовирус1 типобычный герпес
2 типгенитальный герпес
3 типкраснуха
4 тип (цитомегаловирус)цитомегалия
5 тип (Эпштейн-Барр)инфекционный мононуклеоз
папилломы человека (21 штамм)папилломатоз
HAV, HBV, HCVгепатит А, В, С
иммунодефицитаВИЧ, СПИД
Бактерии
бледная трепонемасифилис
гарднереллыгарднереллез
гонококкигонорея
уреаплазмауреаплазмоз
сальмонелласальмонеллез
палочка Кохатуберкулез
листериялистериоз
стрептококки и стафилококкисепсис, пневмония, менингит
Паразиты, прокариоты, простейшие
описторхи (печеночные сосальщики)описторхоз
плазмодиймалярия
токсоплазматоксоплазмоз
лямблиилямблиоз
хламидиихламидиоз
трихомонадатрихомониаз
микоплазмамикоплазмоз
эхинококкиэхинококкоз
шистосомышистосомоз
цестодыальвеококкоз

Комплексный анализ на ЗППП носит название «профиль ПЦР-12», по количеству определяемых возбудителей. В профиль входят половые инфекции:

  • хламидиоз;
  • гонорея;
  • трихомониаз;
  • сифилис;
  • ВИЧ;
  • обычный и генитальный герпес;
  • цитомегалия и инфекционный мононуклеоз;
  • папилломатоз;
  • гепатиты В, С.

А также микоплазмоз и уреаплазмоз – не относящиеся к венерическим болезням, но передающиеся при интимной близости. Отдельный анализ крови ПЦР на кандидоз (молочницу) практикуется редко, поскольку заболевание легко выявляется по мазку из влагалища (у мужчин из уретры).

Показания к проведению ПЦР-12

Прямыми показаниями являются симптоматические проявления, характерные для половых инфекций:

  • длительная фебрильная (38-39 ℃) температура тела;
  • увеличение лимфатических узлов;
  • кожная сыпь;
  • зудящие высыпания в области наружных половых органов;
  • поллакиурия (учащенное мочеиспускание), сопровождающаяся жжением в уретре;
  • боли в нижней части живота, иррадиирующие в поясницу;
  • диспареуния (болезненные ощущения во время интимной близости и после секса);
  • лейкоррея у женщин (неспецифические влагалищные выделения с неприятным запахом) и выделение слизи из уретры у мужчин.

ПЦР-12 рекомендовано пройти при планировании беременности.

Основные симптомы и осложнения половых инфекционных заболеваний

Основные достоинства PCR

Метод полимеразной цепной реакции применяется в совокупности с другими исследованиями или заменяет:

  • Микроскопию (обычную и люминесцентную) – изучение крови под микроскопом (люминесцентным микроскопом).
  • Бактериологический посев – высаживание биоматериала на питательные для паразитов, бактерий и т. д. среды, и выращивание в лабораторных условиях колоний болезнетворных микроорганизмов.
  • Серологические тесты – основаны на выявлении специфических антител (иммуноглобулинов) к антигену (инфекционному агенту): реакция иммунофлуоресценции (РИФ), иммуноферментный анализ (ИФА), реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА).

ПЦР используют для уточнения спорных диагнозов, при получении ложноположительных и ложноотрицательных результатов других анализов. Прерогативы ПЦР-диагностики:

  • Высокая точность типизации возбудителей. Оценка уникальных для каждого микроорганизма фрагментов ДНК и РНК дает возможность распознать конкретный штамм вируса, разновидность паразитов, грибков и бактерий.
  • Гиперчувствительность к инфекционным агентам. Чтобы обнаружить инфекцию, для ПЦР достаточно молекулярного присутствия патогенного микроорганизма.
  • Оперативность проведения анализа. В отличие, к примеру, от бакпосева для выполнения которого требуется 7-14 дней, результаты PCR можно получить через 24 часа (в платных диагностических центрах интервал ожидания может быть сокращен до 5-7 часов).
  • Универсальность. Диагностические возможности метода в области инфекционных болезней практически не ограничены.
  • Комплексность. Одного образца крови достаточно для проведения исследования на несколько патогенных микроорганизмов.
  • Специфичность. При проведении ПЦР исключены перекрестные реакции иммуноглобулинов с близкородственными не комплементарными антигенами, следовательно, невозможен ложноположительный результат исследования.

О недостатках Рolymerase Сhain Reaction можно говорить в свете высоких требований к оснащению лаборатории и квалификации медицинского персонала. Анализ проводится в условиях абсолютной стерильности, со строгим соблюдением температурного режима. Присутствие посторонних ДНК в воздухе может исказить результаты исследования.

Важно! Некоторые виды инфекционных агентов способны мутировать. Такое явление наблюдается редко, но изменение РНК-штамма может стать причиной ошибочной дифференциации. В остальных случаях ПЦР-диагностика близка к идеальной.

Подготовительные мероприятия обеспечивают максимальную объективность результатов исследования. Правила подготовки к ПЦР анализу крови включают:

  • отказ от приема медикаментов за 5-7 дней до сдачи крови;
  • ограничение жирной пищи и исключение из рациона спиртных напитков за 2 дня;
  • сокращение физической активности накануне забора крови;
  • соблюдение режима голодания 8-12 часов (сдавать кровь необходимо натощак).

За час до процедуры рекомендуется отказаться от никотина (не курить). Забор крови производится из вены, в утренние часы. В современных лабораториях, имеющих условия для проведения ПЦР-диагностики, биоматериал берут при помощи стерильных вакутейнеров. Кровь пациента хранится в течение двух недель, что делает возможным проведение дополнительных тестов.

Пример бланка с результатами анализа

О результатах и ценах

Результаты исследования можно получить на следующий день. Количественный показатель, иначе, число полученных копий инфекционного агента, указывается редко. В большинстве случаев пациент получает бланк с качественной интерпретацией результата. Варианты могут быть:

  • «обнаружено» или «положительно» – наличие инфекционного заболевания;
  • «не обнаружено» или «отрицательно» – отсутствие заражения.

Положительный результат при отсутствии выраженных проявлений болезни свидетельствует о латентном бессимптомном течении инфекции или пребывании возбудителя в стадии инкубации. Исследование относится к средней ценовой категории.

В клиниках Москвы и других крупных городов стоимость определения одного вида инфекции варьируется от 300 до 500 руб. Комплексный анализ ПЦР-12, как правило, обходится дешевле, чем проверка на каждый возбудитель отдельно.

Итоги

Полимеразная цепная реакция (реакция амплификации) – современное клинико-диагностическое исследование крови и других биожидкостей человека. Анализ основан на обнаружении и дифференциации молекулярного фрагмента вируса, бактерии и т. д. для определения инфекции или поврежденного гена для выявления мутаций, анормальных отклонений в развитии, наследственных патологий.

Ключевые преимущества ПЦР перед иными лабораторными тестами:

  • диагностика заболеваний в исходном периоде (при отсутствии психосоматических проявлений);
  • обнаружение нескольких патогенов, атакующих организм по одному биообразцу;
  • чувствительность практически ко всем инфекционным агентам;
  • определение начальных (доклинических) форм рака;
  • определение генетических патологий во внутриутробном периоде развития ребенка.

Исследование является высокоинформативным, доступным и оперативным по времени выполнения. Результаты можно получить на следующий день после анализа.

Источник: https://apkhleb.ru/krov/analiz-pcr

Основные виды ПЦР

Пцр анализ виды

Полимеразная цепная реакция была впервые разработана в 1983 году Кари Муллисом. На сегодняшний день существует много разных видов ПЦР.

Некоторыми из них являются – RT-PCR (ПЦР с обратной транскрипцией), touchdown PCR, real time PCR (ПЦР в реальном времени), nested PCR («вложенная» ПЦР), Strand Displacement Amplification (амплификаци со смещением нити), Rolling Circle Amplification (амплификация катящегося кольца), Ligase Chain Reaction, Helicase Dependent DNA amplification и т.д.

Двумя группами различных видов полимеразной цепной реакции являются термоциклические методы ПЦР и методы изотермической амплификации.

Различные виды ПЦР-методов, основанных на термоциклировании (стадии нагревания и охлаждения)

Методы термоциклирования используют циклическое чередование температуры для повторения ДНК синтеза.

Множественная ПЦР (Multiplex PCR)

Мультиплексная ПЦР представляет собой метод ПЦР, который позволяет одновременно амплифицировать множество последовательностей мишеней в одной и той же реакционной смеси.

https://www.youtube.com/watch?v=4FktbwoYx0Q

Так как одна реакционная смесь включает в себя наборы пар праймеров для разных ДНК целей, то это уменьшает потребление реагентов ПЦР и в то же время налагает определенные ограничения на используемые праймеры.

Для одновременной работы в одной реакционной смеси наборы праймеров должны быть оптимизированы.

Они должны иметь одинаковые температуры отжига и производить продукты амплификации (ампликоны) разного размера с образованием четко различимых гель-электрофорезных полос для последующего ПЦР-анализа.

«Гнездовая» или вложенная ПЦР (Nested PCR)

Вложенная ПЦР используется для увеличения специфичности амплификации ДНК путем уменьшения числа побочных продуктов реакции.

В этом методе используются два набора праймеров.

Первый набор обеспечивает первую полимеразную цепную реакцию. Продукт этой реакции служит источником ДНК-мишени для второй ПЦР с использованием второго набора праймеров.

Лигазная цепная реакция (Ligase Chain Reaction, LCR)

Праймеры лигазной цепной реакции намного длиннее, чем обычные праймеры для ПЦР, и предназначены для покрытия всей последовательности, подлежащей амплификации.

На первой стадии отжига праймеры сшивают термостабильной ДНК-лигазой.

Это генерирует фрагмент, который состоит из пары праймеров и служит в качестве шаблона для последующих циклов.

Основным преимуществом лигазной цепной реакции является то, что одноточечная мутация в исходной матричной ДНК может предотвратить реакцию и отсутствие продукта может быть индикатором мутаций.

Количественная ПЦР (Quantitative PCR, qPCR)

Количество продукта, которое синтезируется в течение заданного количества циклов ПЦР, зависит от количества молекул ДНК, которые присутствуют в исходной смеси. Это позволяет использовать ПЦР для количественного определения количества молекул ДНК, присутствующих в экстракте.

В количественной ПЦР количество продукта, синтезированного во время тестовой ПЦР, сравнивают с количествами, синтезированными во время ПЦР, с известными количествами исходной ДНК.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (real-time PCR)

Сегодня квантификация ПЦР проводится в реальном времени – модификация стандартного метода ПЦР, в котором синтез продукта измеряется с течением времени.

Чаще всего этот метод используется для измерения количества РНК. Например, чтобы определить экспрессию конкретного гена в раковых клетках. Этот метод позволяет контролировать развитие рака.

ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR)

Для проведения ПЦР, где РНК является исходным материалом, этот метод ПЦР использует обратную транскриптазу, процесс, называемый ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR).

Первым шагом в этом методе является превращение молекул РНК в одноцепочечную комплементарную ДНК (кДНК). После этого этапа эксперимент протекает так же, как в стандартной методике.

Некоторые термостабильные полимеразы, такие как Tth, обладают обратной транскриптазной активностью в определенных буферных условиях и способны копировать как РНК, так и ДНК молекулы.

Различные виды ПЦР-методов, основанных на изотермической амплификации ДНК

Изотермические методы не зависят от термоциклирования. С ними легче работать и они требуют меньше энергии, чем стандартные методы ПЦР.

Изотермические методы используют ДНК-полимеразы с активностью cмещения нитей.

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)

ПЦР-реакционная смесь для Loop-mediated isothermal amplification имеет ДНК-полимеразу с активностью cмещения нитей вместо Taq-полимеразы. Для проведения реакции смесь выдерживают при постоянной температуре (около 65°С).

Репликация по типу катящегося кольца (Rolling Circle Amplification, RCA)

При репликации по типу катящегося кольца сначала два конца ДНК мишени объединяются вместе с использованием ДНК-лигазы для образования круглого одноцепочечного шаблона. Праймер прикрепляют к этому ДНК шаблону во время отжига. Амплификация выполняется до завершения синтеза круга. Синтезированная цепь смещается из-за свойства полимеразы с активностью cмещения нитей.

Основное преимущество заключается в том, что синтез может происходить при комнатной температуре.

Хеликаз зависимая ДНК амплификация (Helicase-Dependent DNA Amplification, HDA)

Хеликаз зависимая ДНК амплификация зависит от активности ДНК-хеликазы для разделения двухцепочечной ДНК.

Основное преимущество заключается в том, что хеликаза может работать при комнатной температуре.

Источник: https://biology.reachingfordreams.com/ru/%D0%B1%D0%B8%D0%BE%D0%BB%D0%BE%D0%B3%D0%B8%D1%8F/%D0%BC%D0%BE%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%83%D0%BB%D1%8F%D1%80%D0%BD%D0%B0%D1%8F-%D0%B3%D0%B5%D0%BD%D0%B5%D1%82%D0%B8%D0%BA%D0%B0/%D0%BC%D0%B5%D1%82%D0%BE%D0%B4%D1%8B-%D0%BC%D0%BE%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%83%D0%BB%D1%8F%D1%80%D0%BD%D0%BE%D0%B9-%D0%B3%D0%B5%D0%BD%D0%B5%D1%82%D0%B8%D0%BA%D0%B8/92-%D0%BE%D1%81%D0%BD%D0%BE%D0%B2%D0%BD%D1%8B%D0%B5-%D0%B2%D0%B8%D0%B4%D1%8B-%D0%BF%D1%86%D1%80

О здоровье
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: